步驟：
（1）冷凍前24-48小時更換半量或全量培養基，使細胞處于指數生長期。
（2）配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養基、血清，逐滴加入二甲基亞砜（DMSO）至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。
（3）離心收集培養之細胞，用加血清的培養基重懸起細胞，取少量細胞懸浮液(約0.1ml)計數細胞濃度及凍前存活率。
（4）取與細胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細胞懸液，并晃動試管，制成細胞凍存懸液（DMSO最后濃度為5～10％），使細胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標示全之冷凍保存管中，1～2ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。嚴密封口后，注明細胞名稱、代數、日期。然后進行凍存。
注意事項：
（1）欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態，約為80～90％致密度。冷凍前檢測細胞是否仍保有其te有性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。
（2）細胞在液氮中可長期凍存無限shi間，而不會影響細胞活力；在-70度可保存數月。
（3）注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色(以0.22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液，可避免DMSO直接加入時釋放的熱量對細胞的損傷。緩慢逐滴加入細胞懸液是使細胞逐步適應高滲，可降低細胞受損。DMSO可能引起部分白血病細胞株的分化，可換用10%甘油凍存。
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